Filtración por gel

En esta las moléculas son separadas por su tamaño. El gel consiste de una cama de esferas con poros de un tamaño dado. El gel se conoce como sefadex, el cual viene con poros de distintos tamaños. Las moléculas de igual o menor tamaño que el poro entra a las esferas mientras que las moléculas más grandes pasan rápidamente por la columna. Las moléculas de tamaño intermedio pueden entrar las esferas pero pasan menos tiempo en ellas. Las moléculas salen en orden de tamaño por el eluído. Aunque para efectos de este laboratorio las muestras que usaremos están coloreadas, al hacer esta cromatografía en la vida real hay que usar otras pruebas para determinar qué fracciones contienen las muestras de interés, las cuales suelen ser proteínas. Estas pruebas pueden ser mediciones fotométricas, SDS-PAGE o ensayos enzimáticos. Una vez tenemos identificadas las fracciones con las muestras, podemos hacer un "profile" de elución con concentración en con concentración en Y y el volumen de elución en X. El volumen inicial es el "void volume" de la columna. Lo que contiene es en amortiguador que estaba dentro de la columna al empezar. Las moléculas más grandes salen inmediatamente después.

El material que se escoja para la fase estacionaria dependerá del tipo de muestra que estemos corriendo. Cada tipo de gel presenta poros de distinto tamaño. En nuestro caso usaremos Sephadex G-75, que separa moléculas entre 3,000 y 70,000 daltons. Moléculas mayores de 70,000 no estarán a los poros de las esferas.